《ACS AMI》：使用低粘度生物墨水打印異質3D生物結構

生物打印是一個快速發展的領域，旨在通過特定細胞和生物材料的受控空間沉積來重建復雜的生理微環境用于體內再生和體外建模目的。可以通過合成水凝膠來制造微型結構增強的可調性和先進的生物打印技術，支持在微擠壓生物打印中創建復雜的設計。然而，支持全面細胞生物活性（包括細胞粘附、遷移、增殖和分化）的水凝膠是柔軟的且表現出較低的形狀保真度和機械穩定性。

為了應對這一問題，研究人員開發了融合生物打印。在此方面，來自韓國高等科學技術學院的Je-Kyun Park團隊也進行了大量研究，在微結構基底上展示了天然和低粘度水凝膠的高分辨率生物打印。由于其固體基底，該平臺僅限于創建單層水凝膠。近日，該團隊又引入了一種新的平臺，能夠制造具有增強分辨率的多層復雜3D結構，以充分利用生物打印的多功能性。用于使用稱為3D微網格-生物墨水覆蓋結構和互鎖培養（3D MOSAIC）平臺的混合生物制造方法來生物打印天然和細胞相容性哺乳動物水凝膠（圖1）。3D MOSAIC平臺能夠精確沉積低粘度水凝膠，具有增強的可打印性、分辨率和穩定性，同時保留天然水凝膠的理想特性。

相關研究成果以“Hybrid Biofabrication of Heterogeneous 3D Constructs Using Low-Viscosity Bioinks”為題于2023年8月24日發表在《ACS Appl. Mater. Interfaces》上。

作者使用商用FDM 3D打印機在微網上打印聚乳酸(PLA)框架，以方便生打印、堆疊和細胞培養過程中的處理。對同一型號的FDM 3D打印機進行修改并與注射泵集成，以創建內部開發的微擠出生物打印機（圖1A）。微網格的平紋編織，水平和垂直的金屬絲交替地在彼此之上和之下通過，以毛細管釘扎效應支撐打印的水凝膠，并實現高分辨率生物打印（圖1B）。微網格僅占據一小部分打印結構（圖1C）。然后，可以使用設計用于安裝在6孔板中的對準器來對準和堆疊PLA框架的微網格生物墨水層，以形成3D MOSAIC單元（圖1D、E）。基于該平臺，可以使用天然低粘度水凝膠創建復雜的微型組織生物結構，包括懸垂結構和中空結構（圖1F）。

1. 油墨類型、微網格和印刷參數對印刷結構的影響

在微觀尺度上，與宏觀系統相比，表面與體積之比要高得多，導致表面力（例如表面張力）超過體力（例如重力）。接觸角是3D MOSAIC的重要參數，因為它影響生物墨水在微網格上的擴散和粘附。將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)、PDMS與固化劑、纖維蛋白原和明膠以10:1的比例混合的液滴放置在帶有金屬絲的微網上（圖2A、B）。聚合物PDMS和低粘度水凝膠纖維蛋白原和明膠以受控尺寸印刷在微網上（圖2C）。

在本研究中，線對線研究了距離和打印流量作為打印生物墨水尺寸的主要影響因素（圖2D）。研究了線距在63至508 μm之間的微網格，因為該范圍適合高分辨率打印，同時為顯微觀察提供足夠大的開放面積百分比。根據圖2B中纖維蛋白原的微網格尺寸和接觸角計算在相鄰線之間打印水凝膠線的最大流量(Qmax)。當打印在線距為63 μm的微網上時，纖維蛋白原溢出到相鄰泳道，因為打印條件不夠敏感，無法滿足所需的控制（圖2E）。

由于缺乏支撐低粘度水凝膠的微結構，在培養皿上打印的纖維蛋白原寬度比在微網上打印的纖維蛋白原寬度大（圖2E、F）。纖維蛋白原的寬度由線到線的距離統一，并且可以通過增加打印流量來加寬（圖2G）。對于254 μm的線對線距離，纖維蛋白原被打印在微網格的單道上，流速低于計算的Qmax且對于高于其的流速，纖維蛋白原逐道溢出（圖2G、H）。通過側面觀察，還可以在低于Qmax 的打印流速下觀察到打印水凝膠的高度（圖2I）。

因此，基于微網格的生物打印技術產生了具有高分辨率和可控性的結構。微調線距和優化打印參數進一步促進了微網格基底上打印生物墨水的寬度和高度的調節，從而能夠制造具有精確尺寸和均勻性的結構。在之后的實驗均使用線距為254 μm的微網格，因為該尺寸對于具有適當穩定性和分辨率的生物打印結構來說是實用的。

2. 利用低打印性的材料制造復雜的均質和異質結構

生物打印可以創建復雜的3D結構，并精確控制空間組織和幾何形狀。使用從圖2獲得的微網格和打印參數，作者用可打印性較差的天然水凝膠制造了復雜的均質和異質結構。使用單一類型的彩色纖維蛋白原將線條和晶格打印在線距為254 μm的微網上，以演示低粘度水凝膠的高分辨率打印（圖3A、B），還根據圖2G、H中的表征數據調整打印流量，以獲得雙通道格式的相同設計（圖3C、D）。水凝膠輪廓和交叉點的精確分辨率和清晰定義證明了基于微網格的生物打印的先進能力，可以使用粘度遠低于適合微擠出打印的常規范圍的水凝膠創建分隔的微結構。此外，多種類型的生物墨水可以打印在單層微網格上。通過在生物打印機頭上安裝兩個打印噴嘴，彩色明膠和纖維蛋白原依次打印為線條、叉狀結構、雙螺旋和分支結構（圖3F-I）。

3. 3D MOSAIC平臺打印多層和異構3D結構

為了創建更全面和多尺度的仿生結構，細胞相容性水凝膠內的自發和微觀細胞組織可以與微網格上的直接微擠壓印刷相結合。通過應用3D MOSAIC平臺建立基于微網格的生物打印來制造異質和多層3D結構。三組分結構的腎臟模型被概念化為五層，并使用三種類型的熒光染料分子標記纖維蛋白原進行打印（圖4A、B）。打印的纖維蛋白原層在微網上交聯，具有高形狀保真度和結構完整性（圖4C、D）。各個層對齊并堆疊以形成2毫米高的完整3D結構（圖4E）。最終的結構由三種天然低粘度水凝膠組成，具有一般的橢圓形結構，具有部分中空的中部和懸垂的脈管系統和輸尿管突起（圖4F）。通過提供必要的支撐、穩定性和空間控制，微網格促進了在所有三個軸上具有空間自由度的結構的組裝。該結構展示了多學科3D MOSAIC平臺在創建復雜設計方面的多功能性和潛力，這些設計不受印刷適性下限的限制，并且不會變形和塌陷。

為了評估制造過程對細胞活力的影響，對生物墨水混合物后立即在纖維蛋白原中的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)以及在打印40分鐘后直接從注射器和打印噴嘴獲得的生物墨水進行了檢查。在細胞培養過程中，細胞活力也保持較高水平（圖5B、C）。HUVEC均勻分布在打印的水凝膠內，并且在14天的培養期內沒有觀察到打印的纖維蛋白結構明顯變形（圖5B）。因此，在3D MOSAIC平臺中應用低粘度生物墨水不僅可以打印細胞相容性水凝膠，還可以為生物打印提供更溫和的條件。

隨后的研究，作者將細胞水凝膠生物墨水在微網上的可靠印刷擴展到制造更復雜的結構。使用含有HUVEC和肺成纖維細胞(LF)的纖維蛋白原打印五層倒金字塔。生物墨水被打印成輪廓清晰的正方形，尺寸線性增加，HUVEC分布均勻（圖6A）。這些層分別培養并在培養第7天組裝，組成一個高度約2毫米、纖維蛋白壁厚500微米的倒置空心金字塔（圖6B、C）。在制造方面，層的堆疊不受限制，因為微網格有效地固定了印刷的水凝膠結構。重要的一點，3D MOSAIC在模塊化微網格生物墨水的空間和時間組裝方面非常靈活。

此外，使用基于微網格的生物打印，還可以打印這種天然的低粘度水凝膠來制造復雜的結構（圖6D）。共培養第7天，HUVEC形成互連的血管網絡，CD31的免疫熒光染色表明內皮細胞緊密連接的形成，這對于血管樣結構的穩定和維護至關重要（圖6E）。分叉網絡分支的共焦圖像的正交視圖揭示了管狀結構內的管腔（圖6F）。借助3D MOSAIC平臺，通過實施具有生物功能的水凝膠，重建了具有高水平的生物和結構仿生學的生理微環境。

4. 多層TME的制造和分析

3D MOSAIC平臺能夠利用模塊化層構建全面的生理微環境。設計并制作了腫瘤微環境（TME）模型，其中跨多個組裝層建立了細胞相互作用。TME模型由三個環形層組成，每個層包含MDA-MB-23乳腺癌細胞、纖維蛋白以及HUVEC和LF的組合，代表癌癥、細胞外基質和脈管系統成分（圖7A、B）。該設計旨在模擬TME內癌細胞與微血管系統之間的主動相互作用。將三層對齊、組裝并培養長達1周（圖7C）。培養7天后，在 MDA-MB-231細胞的單一培養對照條件下，從其初始層觀察到最小的遷移（圖7D）。

然而，當HUVEC和LF存在于頂層時，轉移性乳腺癌細胞表現出向上遷移，到達中層。此外，觀察到HUVEC向下移動，并且還在中間純纖維蛋白層內發現了HUVEC。頂層的HUVEC在第7天時形成了內皮細胞網絡（圖7E），如之前在圖6中觀察到的。通過正交共焦成像證實了MDA-MB-231細胞的垂直遷移（圖7F）。隨著時間的推移，遷移細胞的數量增加（圖7G）。總的來說，培養的細胞表現出活躍的遷移、基質重塑和增殖，證明了只有使用高細胞相容性生物墨水時才有可能實現的高水平細胞生物活性。

綜上，多學科3D MOSAIC平臺提供了一種有前途的策略，可以使用低打印性的天然水凝膠創建復雜的異質3D結構。微網支撐具有毛細管釘扎效應的低粘度水凝膠，以實現高分辨率結構的生物打印，隨后將其對齊和堆疊以形成多層結構。在平臺中血管生成條件下培養的內皮細胞在生物功能水凝膠內自組織形成血管網絡。此外，成功構建了結合癌細胞、細胞外基質成分和血管元件的TME模型，為研究癌細胞與其周圍微血管之間復雜的相互作用提供了有價值的工具。

文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsami.3c05750

來源： EngineeringForLife