《Biomaterials》:3D打印具有肝臟細胞和靜脈結構的肝臟類器官

當代醫學研究的前沿，3D生物打印技術正以其革命性的潛力，重塑我們對器官再生和移植的認知。

肝臟作為人體的重要器官，具有復雜的生理功能，包括代謝、解毒、合成蛋白質等。然而，傳統的3D打印技術在打印具有復雜結構和功能的肝臟組織方面存在諸多挑戰。為了克服這些挑戰，科學家們一直在探索新的打印技術和材料。

最近，北京協和醫院肝臟外科教授毛一雷、楊華瑜團隊攜手牛津大學生物醫學工程研究所/牛津大學高等研究院 (蘇州) 葉華團隊、中國醫學科學院生物醫學工程研究所/天津醫學健康研究院黃鵬羽團隊，在《Biomaterials》期刊上發表了他們的開創性研究。

研究團隊開發了一種名為“全方位打印嵌入式網絡（OPEN）”的新型支撐介質，成功打印出具有肝臟細胞和靜脈結構的肝臟類器官（HEALs），HEALs在移植后顯著促進了內源性血管新生，這對于提高移植器官的存活率和功能恢復具有重要意義。

合成方法：

1、支撐介質OPEN的制備：

研究者開發了一種新型的支撐介質OPEN，利用Pluronic? F-127 (PF127) 和改性羥丙甲纖維素 (H-HPMC) 通過疏水作用形成網絡結構。通過調整PF127和H-HPMC的比例，優化了OPEN的流變學特性，確保其在室溫到體溫范圍內具有穩定的固體特性和可調節的模量。

2、細胞的分離與培養

從小鼠中分離出主要肝細胞（PMHs），并采用特定的培養基誘導其形成肝細胞球體。同時培養了內皮細胞系C166，用于后續的血管結構打印。

3、生物墨水的制備

將GelMA（一種光交聯的膠原蛋白類似物）與細胞混合，形成適合3D打印的生物墨水。根據打印需要，調整了GelMA、光引發劑LAP以及細胞的濃度。

4、3D打印

使用3D打印機（BioMaker 2, SunP Biotech）進行打印，打印機和打印床的溫度分別設置為20°C和30°C。打印路徑根據肝臟解剖學設計，采用格子狀和圓形路徑分別打印肝臟實質和血管結構。

5、打印后處理

打印完成后，使用紫外線照射固定打印結構。將打印結構轉移到含有α-CD（一種有效的去除劑）的溶液中，以去除OPEN支撐介質。

體外表征：

A. 通過特定的培養條件，肝細胞能夠自發聚集形成球體，這是模擬肝臟自然結構的重要步驟。B. 活/死染色實驗顯示，在體外培養10天后，肝細胞的存活率超過90%，21天后存活率仍高于80%。這表明打印的肝細胞在體外環境中具有較高的生存能力。C. 共聚焦圖像顯示肝細胞球體具有典型的多邊形形態，這是功能性肝細胞的特征之一。D. 通過免疫熒光染色檢測了肝細胞球體中特定肝細胞標記物的表達，如白蛋白（ALB）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）。肝細胞球體在培養10天后顯示出高ALB和AAT的熒光，表明它們具有肝臟功能。E. 糖原儲存的PAS染色結果顯示肝細胞球體能夠儲存糖原，這是肝細胞正常功能的重要指標。F. 低密度脂蛋白攝取的Dil-ac-LDL熒染色結果表明肝細胞球體能夠攝取并儲存低密度脂蛋白，進一步證實了它們的肝臟功能。G. ICG攝取和釋放實驗顯示肝細胞球體能夠在6小時內攝取并釋放ICG，表明它們具有正常的肝臟代謝功能。H. 通過定量實時聚合酶鏈反應（qPCR）分析了肝細胞球體中肝細胞特異性基因的表達。與新鮮分離的PMHs相比，HEAL中的PMHs在10天培養后，ALB和AAT基因表達水平為新鮮PMHs的40%，而Fpn、Krt8和Krt18等其他肝細胞標記基因在HEAL中的表達水平顯著高于2D和3D培養條件，表明HEAL中的肝細胞球體具有更好的肝功能。I. 主成分分析（PCA）結果顯示，HEAL樣本的基因表達模式與新鮮分離的PMHs相似，表明HEAL中的肝細胞球體在基因表達水平上更接近于自然肝細胞。J. 基因表達熱圖展示了與肝發育和肝形態發生相關的基因在PMHs、HEAL、2D和3D培養條件下的表達熱圖。熱圖顯示HEAL中的肝細胞球體在關鍵肝細胞轉錄因子和代謝相關基因的表達上與新鮮PMHs相似，而2D和3D培養條件下的PMHs則表現出顯著差異。

體內移植后新生血管情況

A. 新生血管的示意圖展示了通過保留肝細胞球體裝載層之間的空隙促進內源性新生血管。這種設計利用了打印結構中的空隙，為血管新生提供了空間，從而有助于血管從宿主組織向移植的肝臟組織生長。B. 移植后血管化的HEAL的明場圖像展示了移植后14天的血管化HEAL的明場圖像，顯示了在打印格子結構的自由空間上的血管生成。圖像顯示了在HEAL結構中形成了豐富的血管網絡，這表明移植的肝臟組織能夠與宿主的血管系統相連，從而獲得必要的營養和氧氣。C. 通過尾部注射熒光地克司藍，展示了功能性新血管。熒光圖像清晰顯示了新形成的血管網絡，證明了這些血管是功能性的，能夠運輸血液和營養物質。D. AAT陽性移植部分的新血管熒光圖像展示了在AAT（α1-抗胰蛋白酶）陽性移植部分上的新血管的熒光圖像。AAT是一種肝臟特異性蛋白，其陽性區域表明這些新血管與肝臟組織相連，進一步證實了血管新生的成功。E. 血管密度和總血管長度的定量展示了有無靜脈結構的HEAL的血管密度和總血管長度的定量結果。數據表明，包含靜脈結構的HEAL在平均血管密度和總血管長度上均顯著高于僅打印肝臟結構的HEAL，這表明靜脈結構的引入顯著促進了血管新生。F-G. 肝細胞和血管標記物的共聚焦圖像顯示了肝細胞和新血管的共存，表明這些新血管不僅形成了，而且與肝臟細胞緊密相連，這對于肝臟功能的維持至關重要。H. 血管標記物CD31的共聚焦圖像展示了在血管標記物CD31陽性移植組分上的新血管的共聚焦圖像。CD31是一種內皮細胞標記物，其陽性區域表明新血管的形成是由內皮細胞的增殖和遷移驅動的。I.通過CD31和ALB免疫組化染色，確認了移植后2周內HEAL中維持的肝臟功能和顯著的新生血管。免疫組化染色結果進一步證實了HEAL在移植后不僅保持了肝臟功能，還成功促進了血管新生，這對于移植肝臟的長期存活和功能至關重要。

結論

研究結果表明，利用OPEN和生物墨水打印的HEALs不僅在體外具有生物活性，而且在體內移植后能夠促進血管新生，維持肝臟功能。這為肝臟疾病治療和器官移植提供了新的治療方法。

盡管取得了顯著進展，但研究者也指出，HEALs的結構和功能與真實肝臟相比仍有差距。未來的研究需要進一步優化打印技術、生物墨水和多細胞共培養系統，以更好地模擬肝臟的微環境和功能。


文獻：Zhuoran Jiang, Bao Jin, Zhu Liang, Yinhan Wang, Shuai Ren, Yongfa Huang, Changcan Li, Hang Sun, Yunzhu Li, Li Liu, Nianlin Li, Jinzhuo Wang, Zhanfeng Cui, Pengyu Huang, Huayu Yang, Yilei Mao, Hua Ye,Liver bioprinting within a novel support medium with functionalized spheroids, hepatic vein structures, and enhanced post-transplantation vascularization,Biomaterials

來源：上海醫豆